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貼壁細(xì)胞如何高效傳代?

更新時間:2022-09-29  |  點擊率:748

細(xì)胞培養(yǎng)的本質(zhì)是細(xì)胞克隆技術(shù)。原理就是盡可能給細(xì)胞提供類似于體內(nèi)的環(huán)境,在無菌條件下,給予適當(dāng)?shù)臏囟群退釅A度以及細(xì)胞生長繁殖所必要的營養(yǎng)條件,使其能在體外維持正常的生長繁殖,并保持其結(jié)構(gòu)和功能的技術(shù)。

細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的應(yīng)用十分廣泛,基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究,抗體制備,新藥篩選,基因工程等等都需要用到細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)。

貼壁細(xì)胞如何高效傳代?

貼壁生長的細(xì)胞,在培養(yǎng)瓶或者培養(yǎng)皿長至單層鋪滿的狀態(tài)后后,空間已基本上飽和,細(xì)胞生長、增殖受阻,為使其繼續(xù)擴增或生長,需要進(jìn)行傳代(再培養(yǎng))處理。同時,傳代培養(yǎng)也可用于細(xì)胞種的保存。不僅如此,各種細(xì)胞實驗也是以高效的細(xì)胞傳代為基礎(chǔ)的。

懸浮型細(xì)胞直接分瓶就可以,而貼壁細(xì)胞則需經(jīng)消化等處理后才能分瓶。

一般使用胰蛋白酶,將貼壁細(xì)胞消化成成單個細(xì)胞,也可加入EDTA提高消化能力(EDTA 是一種二價離子的螯合劑,能抑制細(xì)胞膜上的Ca2+和Mg2+)。

常用的細(xì)胞消化液一般含有0.25%(w/v)的胰酶和0.03% (w/v) EDTA。

實驗時,先用吸去細(xì)胞培養(yǎng)上清,用PBS清洗細(xì)胞,棄掉洗滌液,重新加入少量的胰酶-EDTA 消化液(根據(jù)培養(yǎng)皿的大小不同,一般2-5ml消化液即可,以剛好鋪滿整個皿底為原則),觀察細(xì)胞直到細(xì)胞變圓脫離瓶壁,此過程一般需要3-5分鐘,為了避免細(xì)胞成團,消化細(xì)胞的過程中不要拍打細(xì)胞瓶。對于特別難消化的細(xì)胞,可以加入胰酶EDTA 消化液后把細(xì)胞置于37°C 促進(jìn)消化,細(xì)胞脫離瓶壁后,立刻加入含有血清的*培養(yǎng)基中止消化。

800-1000rpm,離心5分鐘,然后棄去中止用的培養(yǎng)基,加入適合的新的培養(yǎng)基輕輕混勻細(xì)胞,移入到新的培養(yǎng)瓶。傳代的比例視細(xì)胞類型而定。胰蛋白酶會對某些細(xì)胞的細(xì)胞膜產(chǎn)生損傷,對于這種類型的細(xì)胞,可用細(xì)胞刮輕輕刮下細(xì)胞,加入適量的培養(yǎng)基,輕輕吹打混勻細(xì)胞,然后進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

WHO公布的《用動物細(xì)胞體外培養(yǎng)生產(chǎn)生物制品規(guī)程》中的要求:

1、牛血清必須來自有文件證明無牛海綿狀腦病的牛群或國家,并應(yīng)具備適當(dāng)?shù)谋O(jiān)測系統(tǒng)。

2、有些國家還要求牛血清來自未用過反芻動物蛋白飼料的牛群。

3、證明所用牛血清中不含對所生產(chǎn)疫苗病毒的抑制物。

4、血清要通過濾膜過濾除菌,保證無菌。

5、無細(xì)菌、霉菌、支原體和病毒的污染,有些國家要求無細(xì)菌噬菌體污染。

6、對細(xì)胞有良好的支持繁殖作用。

我國對牛血清的質(zhì)量中提出比較嚴(yán)格的標(biāo)準(zhǔn)要求:

包括蛋白質(zhì)含量,細(xì)菌、真菌、支原體、牛病毒、大腸桿菌噬菌體、細(xì)菌內(nèi)毒素,支持細(xì)胞增殖檢查。一款來自澳洲的Ausbian®胎牛血清在市場上頗受歡迎。它具有精選內(nèi)毒素極低、產(chǎn)量充足的血清批次,滿足干細(xì)胞、基因敲除、原代培養(yǎng)、細(xì)胞典藏、長期傳代等各類細(xì)胞的培養(yǎng)要求;澳洲血源,完整的檢測報告及滅病毒服務(wù),為各類臨床相關(guān)項目的申報提供完整支持等特點。


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