外泌體大家應(yīng)該都很熟悉。1983年，在綿羊網(wǎng)織紅細胞中發(fā)現(xiàn)了現(xiàn)在生物學(xué)研究領(lǐng)域炙手可熱的“小網(wǎng)紅"——一種特殊囊泡結(jié)構(gòu)，并與1987年正式被命名為“exosome"。

外泌體是指包含了復(fù)雜 RNA 和蛋白質(zhì)的小膜泡 (30-150nm)，現(xiàn)今，其特指直徑在40-100nm的盤狀囊泡。為細胞間通訊的重要媒介，它像一個信使，為細胞與胞外環(huán)境傳遞信息，保障機體的正常工作。

越來越多的科研人員投入到外泌體的研究中，根據(jù)PubMed統(tǒng)計顯示，最近幾年，外泌體研究呈爆炸增長。

外泌體的研究離不開細胞培養(yǎng)。以腫瘤相關(guān)外泌體研究為例，目前，收集腫瘤細胞外泌體主要有兩種方法：

方法一

使用正常培液養(yǎng)細胞再換無血清培液收外泌體。

方法二

直接使用exosome-free FBS配制培養(yǎng)基用于培養(yǎng)細胞收外泌體。

從現(xiàn)有的一些研究可以看出[1][2][3][4][5]，研究人員更傾向于方法二，也就是使用exosome-free FBS培養(yǎng)細胞再收上清分離exosomes的方法，至少腫瘤研究方面是這樣的。

相關(guān)文獻[1] Zhou W , Fong M , Min Y , et al. Cancer-Secreted miR-105 Destroys Vascular Endothelial Barriers to Promote Metastasis[J]. Cancer Cell, 2014.

[2] Boelens M , Wu T , Nabet B , et al. Exosome Transfer from Stromal to Breast Cancer Cells Regulates Therapy Resistance Pathways[J]. Cell, 2014, 159(3):499-513.

[3] Pancreatic cancer exosomes initiate pre-metastatic niche formation in the liver[J]. Nature Cell Biology, 2015, 17(6):816-826.

[4] Tumour exosome integrins determine organotropic metastasis[J]. Nature, 2020, 2015，527(7578):329-35.

[5] Melo S A , Luecke L B , Kahlert C , et al. Glypican-1 identifies cancer exosomes and detects early pancreatic cancer[J]. Nature, 2015, 523(7559):177-182.

所以，接下來就講講exosome-free FBS——無外泌體血清。

顧名思義，無外泌體血清就是外泌體含量極低，低到幾乎沒有的血清（以粒徑分析結(jié)果為標準），獲得主要有兩種途徑：

直接購買商品化的產(chǎn)品

自己DIY制備

如果選擇自己制備無外泌體血清，常用的方法就是超速離心法。主要有三種策略：（前提是將血清用正確的方法*解凍，分裝，按照實驗需求選擇合適用量進行去除外泌體的實驗，血清解凍方法請參照這里??：如何解凍血清才能大程度保證活性？）

將血清與培養(yǎng)基1：4比例稀釋，然后超速離心10000g過夜收集上清；

直接將血清速離心10000g過夜收集上清；

180000g離心3-6小時收集上清。

P.S.其中，離心的過夜時間要視情況而定，一般在10-14小時之間，也可適當(dāng)延長離心時間。

需要注意的是，離心后，外泌體會富集在試管底部，在吸取上層血清的時候，不要觸碰底部沉淀，避免吸到沉底的外泌體，“一夜回到解放前"。

另外，只吸取80%左右的上層血清，其余的渾濁血清留作其他非外泌體用途細胞的培養(yǎng)，畢竟血清也挺貴的，避免不必要的浪費。

針對超速離心后的血清，可進行粒徑檢測（離心前樣品和離心后樣品），如果覺得純度不夠，再把離心后收集的血清做二次離心。

當(dāng)然啦，以上方法也只是我們根據(jù)已有文獻和相關(guān)實驗室的經(jīng)驗總結(jié)得來的，僅供大家參考，如果有更好的方法，也歡迎在評論區(qū)和我們交流！

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